本发明提供了一种Brevilin A的新用途——Brevilin A作为JAK-STATs信号特异性抑制剂的应用。通过细胞模型筛选实验和蛋白分子检测证明，Brevilin A具有良好的JAK-STATs信号抑制活性，并且能有效抑制相关基因的表达，从而可以有效抑制JAK-STATs信号依赖的细胞的生长，因此，以Brevilin A为活性成分，可用于制备基于JAKs为靶点或JAK-STATs信号为目标的药物，治疗JAK-STATs信号活化相关的疾病：以BrevilinA为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的靶向药物，如各种口服制剂和注射剂等。
1.Brevilinxa0A对STAT3所调控下游基因socs3的转录抑制的分析方法，该方法是：HEK293T、Hela和HepG2于10xa0cmxa0细胞培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换无血清培养基过夜，向HEK293T加入10μMxa0Brevilinxa0A预处理30xa0min，向Hela和HepG2分别加入15μMxa0Brevilinxa0A预处理30xa0min，同时以加入等量xa0DMSOxa0作为对照，用250xa0ng/mlxa0IL-6处理4xa0h后提取总RNA，反转录后，做半定量PCR分析。技术领域
本发明属于医药应用领域，涉及一种xa0Brevilinxa0Axa0的医药新用途，尤其涉及Brevilinxa0Axa0作为xa0JAK-STATsxa0信号靶向抑制剂的应用。xa0
背景技术
xa0细胞中JAK-STATs信号对细胞信号的传导及各项生理活动至关重要，该家族信号的异常会导致众多疾病的发生，包括癌症和免疫相关疾病。JAKs（Janusxa0Kinase）家族包括JAK1,JAK2,JAK3和Tyk2四个成员。而JAKs下游的STATs（Signalxa0transducerxa0andxa0activatorxa0ofxa0transcription）家族包含7个成员（STAT1-STAT6，其中STAT5Axa0和STAT5B有两个独立的基因编码）。在许多人类实体瘤及血液相关疾病中，通常STATs活性表现为异常，最常见的为STAT3过度活（Bowmanxa0etxa0al.,xa02000;xa0Garciaxa0andxa0Jove,xa01998;xa0Yuxa0etxa0al.,xa02009）。xa0xa0xa0xa0xa0在众多STAT3异常活化的肿瘤细胞中，抑制STAT3信号能有效抑制细胞生长、诱导细胞凋亡和减少肿瘤细胞的转移（Iwamaruxa0etxa0al.,xa02007;xa0Rahamanxa0etxa0al.,xa02002）。如在神经胶质瘤（Iwamaruxa0etxa0al.,xa02007;xa0Rahamanxa0etxa0al.,xa02002）、乳腺癌（Garciaxa0etxa0al.,xa02001）、结肠癌）、前列腺癌），黑色素瘤（Niuxa0etxa0al.,xa02002;xa0Niuxa0etxa0al.,xa01999）等细胞中，通过STAT3抑制蛋白表达、小干扰xa0RNA或特异性抑制剂来抑制STAT3抑制剂，能显著下调STAT3下游相关基因，如CyclinD1、Bcl-xl、c-Myc、Survivin等，从而调节肿瘤细胞周期减缓细胞增殖，增加凋亡（Weerasinghexa0etxa0al.,xa02007;xa0Zhangxa0etxa0al.,xa02012）。作为xa0STATsxa0家族上游最重要的激酶，由于突变或其他原因引起的JAKs活性过高,持续激活下游蛋白（主要如STATs家族），与上述肿瘤疾病相关外，通常会与血液疾病、自身免疫疾病相关（Baxterxa0etxa0al.,xa02005;xa0Jamesxa0etxa0al.,xa02005;xa0Kralovicsxa0etxa0al.,xa02005;xa0Levinexa0etxa0al.,xa02005;xa0Mullighanxa0etxa0al.,xa02009）。综上所述在这些相关的疾病中，抑制JAK-STATsxa0信号将有效抑制和缓解该信号异常活化带来的疾病。xa0Brevilinxa0A是一种天然产物，可从鹅不食草、短叶老鹤草等天然植物中提取，其结构为：xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="252"/>xa0中国专利申请201110423357.7公开了一种以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用，在筛选相关抑制剂的过程中，发现xa0Brevilinxa0Axa0能有效抑制所选用筛药模型中的荧光素酶活性，经过进一步验证发现，Brevilinxa0Axa0对xa0JAK-STATsxa0信号特别是xa0JAKsxa0家族激酶活性及下游STAT3有稳定的抑制效果，且在细胞水平具有高效低毒的抑制效果，能对STAT3信号依赖的细胞具有较好的抑制作用。由于Brevilinxa0A本身是天然中草药的成分，其副作用在可控范围之内，故作为JAK-STATs信号抑制剂有很大潜力开发成药物，治疗由于JAK-STATs持续活化造成的相关疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种xa0Brevilinxa0Axa0的新用途——Brevilinxa0A作为JAK-STATsxa0信号抑制剂的应用。xa0下面以STAT3为例，通过细胞实验来说明Brevilinxa0A对JAK-STATs信号的抑制作用。xa0仪器：PerkinElmerxa0Victor3xa0荧光/化学发光分析仪，xa0Bioradxa0蛋白质电泳及转印系统，Biorad荧光定量PCR分析仪。xa0试剂：萤火虫荧光素酶测定试剂盒以及RNA反转录试剂盒购自Promega公司；IL-6购自Peprotech公司；Brevilinxa0A购自BioBioPhaxa0公司；DMEM（高糖）及胎牛血清购自Hyclone（Thermo公司）；各种抗体购自Cellxa0Signalingxa0Technology公司；总RNA提取试剂盒购自天根公司；MTT购自上海生工。xa01、不同浓度xa0BrevlinAxa0对xa0STAT3xa0活性的抑制实验xa0使用以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型（药物筛选细胞模型的结构参见中国专利201110423357.7）验证BrevlinA对STAT3活性的抑制，分别用浓度为20xa0μM、17.5xa0μM、15xa0μM、12.5xa0μM、10xa0μM、7.5xa0μM、5xa0μM、2.5xa0μMxa0以及1xa0μM的Brevilinxa0A处理药物筛选模型细胞株A549R，24小时后测定荧光；同时以MTT实验测定相应浓度下Brevilinxa0A对该细胞的生长抑制作用。以10,000xa0个/孔将细胞铺于96孔板，12hxa0后，将Brevilinxa0A按上述浓度用完全培养基稀释，吸掉原来的培养基，加入含有Brevilinxa0A的培养基，每个浓度n=10。Brevilinxa0A母液用DMSO溶解，所用浓度培养基中DMSO含量不超过0.2%，并以不含Brevilinxa0A的DMSO作为对照。24xa0hxa0后，5孔测定荧光素酶活性，5孔用MTT实验测定。测定荧光素酶活性时，每孔加入xa050xa0μl稳定性荧光素酶底物，室温避光孵育10xa0min后，用荧光或化学发光分析仪测定荧光值。MTT试验中，加入xa020μlxa0xa05xa0mg/mlxa0MTT母液，37孵育2h后测定吸光值。（三次重复试验；***,xa0p<0.001）。xa0图1为不同浓度Brevilinxa0A对STAT3活性的抑制率。图1的结果表明，24xa0h内，Brevilinxa0A对STAT3信号的抑制呈浓度依赖效应。xa0图2xa0为Western-Blot检测使用Brevilinxa0A处理A549R细胞对STAT3信号的抑制。图2表明，与荧光信号对应浓度的Brevilinxa0A处理A549R细胞xa024小时后，STAT3活性被显著抑制，以Tyr705-STAT3磷酸化“pTyr705-STAT3”表示。xa02、BrevlinA对STAT3持续活化细胞的抑制xa0文献报道，在STAT3持续活化细胞中，抑制xa0STAT3xa0将明显抑制这一类细胞的增殖及生长，人乳腺癌细胞xa0MDA-MB-468xa0及人前列腺癌细胞xa0DU145xa0就是典型的STAT3持续活化细胞，抑制xa0STAT3xa0将有效抑制这两种细胞的增殖，故用来验证xa0BrevlinAxa0的效果。DU145和xa0MDA-MB-468xa0细胞于10xa0cmxa0细胞培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换新鲜完全培养基，加入xa0Brevilinxa0Axa0处理xa02xa0h（10xa0μM），同时以加入等量xa0DMSOxa0作为对照，提取总蛋白，进行xa0Western-Blotxa0分析。结果见图3。xa0图3的结果表明，使用10xa0μM的xa0Brevilinxa0Axa0处理DU145细胞xa02xa0h，能有效抑制DU145xa0和MDA-MB-468的STAT3活性，同时对其他信号如AKT信号途径（以Ser473-AKT，及下游Ser9-GSK-3β的磷酸化“pSer473-AKT”、“pSer9-GSK-3β”表示）无显著影响。xa0使用Brevilinxa0A长时间处理DU145和MDA-MB-468细胞，以人正常上皮细胞hTERT-BJ作为对照：将相同数目hTERT-BJ、DU145和MDA-MB-468细胞接种于96孔板至汇合度25%，换含有10xa0μM的Brevilinxa0A的完全培养基处理细胞，以含有DMSO的完全培养基作为对照，分别处理24xa0h、48xa0h、72xa0h，加入20μlxa05xa0mg/mlxa0MTT母液，37孵育2h后测定吸光值（n=5，三次重复试验）。xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0图4为Brevilinxa0A对hTERT-BJ、DU145和MDA-MB-468细胞的抑制效果。图4的结果显示，Brevilinxa0A对STAT3信号依赖的DU145和MDA-MB-468有更强的生长抑制作用。xa0xa03、Brevlinxa0A对由细胞因子介导的STAT3信号活化的抑制xa0使用IL-6刺激不同细胞后检测Brevilinxa0A的抑制作用。HEK293T、Hela和HepG2于10xa0cmxa0细胞于培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换无血清培养基过夜，加入Brevilinxa0A预处理30xa0min（10xa0μM），同时以加入等量DMSO作为对照，IL-6（250xa0ng/ml）处理2xa0h后提取总蛋白。图5为Western-blotxa0检测Brevilinxa0A对细胞因子IL-6介导的STAT3活性的抑制。图5的结果表明，Brevilinxa0A能有效抑制IL-6激活的STAT3活化。xa0同样的方法，使用Brevilinxa0A预处理Hela细胞后，使用IFNα（5000xa0U/ml0或IFNγ（1500xa0U/ml）xa02xa0h后提取总蛋白。xa0图6为Western-blotxa0检测Brevilinxa0A对细胞因子IFNα或IFNγ介导的STAT3活性的抑制。图6显示，Brevilinxa0A能有效抑制IFNα或xa0IFNγxa0介导的STAT3活化。xa0进一步实验表明Brevilinxa0A也能有效抑制EGF、OSM、LIF、GM-CSF介导的STAT3信号活化。xa04、Brevilinxa0A对STAT3所调控下游基因的转录抑制xa0HEK293T、Hela和xa0HepG2于10xa0cmxa0细胞培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换无血清培养基过夜，加入Brevilinxa0A预处理30xa0min（HEK293T，10xa0μM；Helaxa0和HepG2，15xa0μMxa0），同时以加入等量xa0DMSOxa0作为对照，IL-6（250xa0ng/ml）处理4xa0h后提取总RNA，反转录后，做半定量分析。图7为半定量xa0PCRxa0分析xa0Brevilinxa0Axa0对细胞因子IL-6介导的STAT3下游基因socs3的转录抑制。图7的结果表明，使用xa0Brevilinxa0Axa0预处理细胞后，IL-6诱导的xa0STAT3xa0下游基因socs3xa0mRNA水平明显低于未用xa0Brevilinxa0Axa0预处理的细胞，证明Brevilinxa0A可以抑制由STAT3调控的下游基因的转录。xa05、Brevilinxa0Axa0在细胞中抑制STAT3上游JAKs家族激酶结构域JH1的活性xa0进一步研究表明Brevilinxa0A涉及到对STAT3上游活性的抑制，从而抑制了STAT3活性。在HEK293T细胞中使用慢病毒载体稳定过表达JAKs家族激酶结构域JH1，分别为pLV-JAK1-JH1、xa0pLV-JAK2-JH1、xa0pLV-JAK3-JH1和pLV-Tyk2-JH1，均带上His标签，同时pLV空载体作为对照。图8为xa0Western-Blotxa0检测xa0Brevilinxa0Axa0对JAKs家族酪氨酸激酶活性的抑制。图8的结果表明，使用Brevilinxa0A处理细胞，能有效抑制JAKs-JH1的酪氨酸激酶对底物蛋白的酪氨酸的催化活性。表达JAK1-JH1,xa0JAK2-JH1,xa0JAK3-JH1和Tyk2-JH1（“anti-His”表示）的xa0HEK293Txa0细胞于培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换无血清培养基过夜，加入Brevilinxa0A（15xa0μM）处理4xa0h后提取总蛋白。使用抗酪氨酸磷酸化抗体检测胞内底物蛋白的总体磷酸化水平的变化（“anti-pTyr”表示），发现Brevilinxa0A能有效抑制JAKs-JH1酪氨酸激酶域的对底物蛋白的催化能力。xa0大量实验证明，Brevilinxa0Axa0对JAKs家族蛋白抑制后可以抑制除了STAT3以外的其余STATs成员，包括STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6。xa0实验证明，Brevilinxa0A对具有持续活化JAK-STATs信号依赖的细胞均有显著的作用，包括前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、白血病细胞。xa0通过细胞模型筛选实验和蛋白分子检测证明，Brevilinxa0A具有良好的xa0JAK-STATsxa0信号抑制活性，并且能有效抑制相关基因的表达，从而可以有效抑制xa0JAK-STATsxa0信号依赖的细胞的生长，因此，以Brevilinxa0A为活性成分，可用于制备基于JAKs为靶点或JAK-STATs信号为目标的药物，在实际应用中可以Brevilinxa0A为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的JAK-STATs信号靶向药物。xa0
附图说明
图1为不同浓度xa0Brevilinxa0Axa0对xa0STAT3xa0活性的抑制率；xa0图2为xa0Western-Blotxa0检测xa0Brevilinxa0Axa0对A549R细胞中STAT3信号的抑制；图3为xa0Western-Blotxa0检测xa0Brevilinxa0A对xa0DU145和xa0MDA-MB-468xa0的信号影响；图4为Brevilinxa0Axa0对STAT3信号依赖的xa0DU145xa0和xa0MDA-MB-468xa0细胞的抑制效果图；图5为xa0Western-blotxa0检测xa0Brevilinxa0A对细胞因子IL-6介导的STAT3活性的抑制；图6为xa0Western-blotxa0检测xa0Brevilinxa0Axa0对细胞因子xa0IFNα或IFNγ介导的STAT3活性的抑制；图7为半定量PCR分析Brevilinxa0A对细胞因子IL-6介导的STAT3下游基因socs3的转录抑制；图8为xa0Western-Blotxa0检测xa0Brevilinxa0Axa0对JAKs家族酪氨酸激酶活性的抑制。
具体实施方式
下面具体实施例对本发明Brevilinxa0A作为活性成分，在制备JAK-STATs信号靶向药物中的应用做进一步说明。xa0实施例1、Brevilinxa0A片剂的制备xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0配方：xa0Brevilinxa0A（纯度大于95%）xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa020.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0填充剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0180.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0崩解剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa010.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0黏合剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa06.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0润滑剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa03.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0共计xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0200.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0工艺：按制备片剂的常规工艺制成片剂1000片，每片含Brevilinxa0Axa020mg。实施例2：Brevilinxa0A胶囊的制备xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0配方：Brevilinxa0A（纯度大于95%）xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa050.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0填充剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa085.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0黏合剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa05.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0润滑剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa010.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0共计xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0200.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0工艺：按制备胶囊剂的常规工艺制成1000粒，每粒胶囊含Brevilinxa0Axa050mg。实施例3、Brevilinxa0A注射液的制备xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0配方：Brevilinxa0A（纯度大于95%）xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0100.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0枸橼酸xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0枸橼酸钠xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00.5gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0氯化钠xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa018.0gxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0注射用水xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa02000mlxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0工艺：按制备注射剂的常规工艺操作，共制成2ml的注射剂1000支，每支Brevilinxa0Axa0100mg。上述各实施例中的填充剂、崩解剂、xa0黏合剂、润滑剂等辅料均为药剂学上最常规的辅料。xa0